wykorzystanie elektroforezy kapilarnej w analizie żywności, PRAWO ŻYWNOŚCIOWE, Analiza żywności
[ Pobierz całość w formacie PDF ]
ŻYWNOŚĆ. Nauka. Technologia. Jakość, 2008, 2 (57), 5 – 14
EWA CIEŚLIK, AGNIESZKA NIEDOŚPIAŁ, BARBARA MICKOWSKA
WYKORZYSTANIE ELEKTROFOREZY KAPILARNEJ
W ANALIZIE ŻYWNOŚCI
S t r e s z c z e n i e
Wysokosprawna elektroforeza kapilarna (CE) jest metodą stosowaną do rozdziału, identyfikacji i ilo-
ściowego oznaczania wielu związków w produktach spożywczych. Dzięki swej różnorodności techniki
elektroforezy kapilarnej mogą być wykorzystywane do oznaczania zawartości zarówno związków wielko-
cząsteczkowych, np. białek czy fragmentów DNA, jak i drobnocząsteczkowych: aminokwasów, węglo-
wodanów, witamin, flawonoidów, jonów nieorganicznych oraz kwasów organicznych.
Zastosowanie tej metody w laboratoriach kontroli żywności może znacznie ułatwić weryfikowanie de-
klarowanego i rzeczywistego składu produktów żywnościowych.
Słowa kluczowe:
elektroforeza kapilarna, żywność
Wprowadzenie
Elektroforeza kapilarna (ang. Capillary Electrophoresis, CE) jest stosunkowo no-
wą metodą analityczną. Została wprowadzona do praktyki laboratoryjnej na przełomie
lat 80. i 90. ubiegłego stulecia i od tego czasu rozwija się, znajdując coraz szersze za-
stosowanie, m.in. w analizie żywności oraz zanieczyszczeń środowiska, a także w ba-
daniach biochemicznych, farmaceutycznych i klinicznych. Najszerszy zakres zastoso-
wań CE dotyczy substancji polarnych jonowych i niejonowych oraz niepolarnych
niejonowych. Wykorzystywana jest ona do oznaczania zawartości węglowodanów,
kwasów nukleinowych, oligonukleotydów, aminokwasów, peptydów, białek, leków,
witamin i jonów nieorganicznych.
Proces rozdziału składników próbki przebiega w kwarcowej kapilarze wypełnio-
nej roztworem elektrolitu podstawowego (buforem) o określonym pH. Najczęściej
stosowane są kapilary o średnicy wewnętrznej w zakresie od 25 do 100 μm i długości
20 do100 cm. Kapilary wraz z elektrodami umieszcza się w naczynkach wypełnionych
Prof. dr hab. E. Cieślik, mgr A. Niedośpiał, mgr B. Mickowska, Małopolskie Centrum Monitoringu
i Atestacji Żywności, Wydz. Technologii Żywności, Uniwersytet Rolniczy w Krakowie, ul. Balicka 122,
30-149 Kraków
6
Ewa Cieślik, Agnieszka Niedośpiał, Barbara Mickowska
tym samym buforem, który znajduje się w kapilarze. W momencie przyłożenia wyso-
kiego napięcia cząstki obdarzone ładunkiem przemieszczają się w kierunku elektrod
z różną prędkością. Zastosowanie odpowiedniego systemu detekcji badanych substan-
cji pozwala na rejestrację wyników analiz w formie elektroforegramu
(rys. 1) [2].
Rys.1. Schemat układu pomiarowego.
Fig. 1. Schematic diagram of the measuring system.
Źródło/Source: opracowanie własne / the author’s own study
Techniki elektroforetyczne
Szerokie zastosowanie elektroforezy kapilarnej wynika z występowania jej licz-
nych odmian różniących się pod względem procesu rozdziału oznaczanych substancji.
Poniżej przedstawiono podstawowe techniki.
Kapilarna elektroforeza strefowa
Proces rozdziału analizowanych związków metodą kapilarnej elektroforezy stre-
fowej (ang. Capillary Zone Electrophoresis, CZE) uzależniony jest od różnicy stosunku
ładunku do masy badanych cząsteczek. Rozdział następuje wewnątrz kwarcowej kapi-
lary, wypełnionej odpowiednim elektrolitem pod wpływem przyłożonego napięcia.
Powoduje to, że składniki próbki rozdzielają się poruszając z różną prędkością w kie-
runku okna detektora. Metoda ta pozwala na rozdzielanie zarówno substancji drobno-,
jak i wielkocząsteczkowych, np. węglowodanów, witamin, peptydów, białek, kwasów
organicznych czy jonów.
WYKORZYSTANIE ELEKTROFOREZY KAPILARNEJ W ANALIZIE ŻYWNOŚCI
7
Micelarna chromatografia elektrokinetyczna
Micelarna chromatografia elektrokinetyczna
(
ang. Micellar Electrokinetic Chro-
matography, MEKC) stosowana jest głównie do rozdziału składników mieszanin, któ-
rych cząsteczki są obdarzone ładunkiem, jak również elektrycznie obojętnych. W me-
todzie tej do buforu dodaje się środek powierzchniowo czynny (surfaktant) tworzący
micele w polarnej cieczy. Micele tworzą się po osiągnięciu krytycznego stężenia mice-
larnego (CMC), które jest charakterystyczne dla danego surfaktanta. Rozdział zachodzi
w wyniku podziału analizowanych składników między micele (środowisko hydrofo-
bowe) i bufor (środowisko hydrofilowe) - cząsteczki niepolarne wnikają w micele,
natomiast polarne pozostają w buforze. Wykorzystując tę technikę można rozdzielić
np.: węglowodany, witaminy, farmaceutyki, aminokwasy, peptydy, oligonukleotydy.
Źelowa elektroforeza kapilarna
W żelowej elektroforezie kapilarnej (ang. Capillary Gel Elektrophoresis, CGE)
rozdział substancji wielkocząsteczkowych następuje w wyniku różnicy ich wielkości.
Proces ten przebiega w kapilarze wypełnionej żelem o odpowiedniej średnicy porów.
Dzięki CGE możliwy jest rozdział kwasów nukleinowych, oligonukleotydów, pepty-
dów oraz białek.
Kapilarne ogniskowanie izoelektryczne
W kapilarnym ogniskowaniu izoelektrycznym (ang. Capillary Isoelectric Focu-
sing, CIEF) składniki mieszaniny rozdzielane są na podstawie różnicy wartości punk-
tów izoelektrycznych (pI). W kapilarze generowany jest gradient pH, od najniższego
przy wlocie do najwyższego przy wylocie kapilary. Po przyłożeniu napięcia składniki
próbki poruszają się do momentu osiągnięcia strefy pH odpowiadającej pI danej sub-
stancji. Za pomocą CIEF rozdziela się głównie substancje o właściwoścach amfote-
rycznych (aminokwasy, peptydy, białka).
Technika izotachoforezy kapilarnej
Rozdział techniką izotachoforezy kapilarnej
(
ang. Capillary Isotachophoresis
CITP) prowadzony jest z zastosowaniem niejednorodnego elektrolitu. Badana próbka
wprowadzana jest do kapilary między dwa bufory: „wiodący” o ruchliwości jonów
większej niż oznaczane jony próbki i „kończący” o ruchliwości jonu mniejszej niż jony
próbki. Po przyłożeniu napięcia rozdzielane jony ustawiają się za buforem „wiodą-
cym” według malejącej ruchliwości. Wykorzystując tę technikę głównie oznacza się
jony, peptydy i białka.
8
Ewa Cieślik, Agnieszka Niedośpiał, Barbara Mickowska
Elektrochromatografia kapilarna
W elektrochromatografii kapilarnej (ang. Capillary Electrochromatography, CEC)
składniki jednorodnych mieszanin rozdzielane są w wyniku ich podziału pomiędzy
fazę stacjonarną i ruchomą. W przypadku analitów obdarzonych ładunkiem wykorzy-
stywana jest również ich ruchliwość w polu elektrycznym – stąd technika ta umożliwia
rozdział jonów [55].
Praktyczne zastosowanie aparatury do elektroforezy kapilarnej w oznaczaniu
różnych związków w produktach spożywczych
Wykorzystując aparaturę do elektroforezy kapilarnej możliwe jest oznaczanie za-
wartości różnych związków chemicznych o znaczeniu żywieniowym. Wśród nich są:
białka i aminokwasy, węglowodany, witaminy, flawonoidy, kwasy organiczne i inne.
Białka i aminokwasy znajdujące się w produktach spożywczych należą do naj-
ważniejszych składników odżywczych żywności. Za pomocą elektroforezy kapilarnej
powszechnie oznacza się frakcje białkowe mleka krowiego, koziego i owczego
(β-laktoglobulinę A, β-laktoglobulinę B, α-laktoalbuminę, albuminy i immunoglobuli-
ny G) [13, 43]. Stosując tę technikę można stwierdzić, czy świeże mleko zawierało
dodatek mleka w proszku [31]. Natomiast określając ilość kazeiny i białek serwatko-
wych w mleku krowim można na tej podstawie stwierdzić obecność mleka innego
gatunku, np. koziego [49].
Przy użyciu metody elektroforezy kapilarnej możliwe jest również oznaczanie
białek w jajach kurzych, np. albuminy i lizozymu [11]. Bietz i Schmalzried [6], stosu-
jąc kapilarną elektroforezę strefową, oznaczyli gliadyny w trzech różnych gatunkach
pszenicy hodowlanej. Najlepszy rozdział uzyskali z wykorzystaniem kapilary o średni-
cy 50 µm i długości 57 cm, natomiast jako bufor rozdzielający użyli 60 mM bufor
boranowy o pH 9, który dodatkowo zawierał 20 % acetonitrylu i 1 % SDS. Detekcję
analizowanych składników prowadzono przy użyciu detektora spektrofotometryczne-
go, stosując długość fali 200 nm.
Na podstawie oznaczenia zawartości białek w orzeszkach ziemnych można
stwierdzić czy są one już dojrzałe i nadają się do spożycia [12]. Lookhart i Bean [39]
wykorzystali metodę CZE do oznaczania zawartości białek w pszenicy, życie, owsie,
jęczmieniu i ryżu. Najlepsze wyniki uzyskano, stosując kwarcową kapilarę o średnicy
50 µm, jako buforu rozdzielającego użyto 50 mM kwasu iminodioctowego z dodat-
kiem 20 % acetonitrylu i 0,05 % HPMC. Rozdział prowadzono w temp. 45
o
C, a de-
tekcję spektrofotometryczną przy długości fali 200 nm.
Stosując metodę elektroforezy kapilarnej, możliwe jest ponadto oznaczanie za-
wartości aminokwasów w napojach, takich jak: soki [33], piwo [15] czy wino [42].
Przykładowo, w soku pomarańczowym oznaczono zawartość aminokwasów (argininę,
WYKORZYSTANIE ELEKTROFOREZY KAPILARNEJ W ANALIZIE ŻYWNOŚCI
9
alaninę, serynę, asparaginę, tryptofan, kwas glutaminowy, fenyloalaninę, tyrozynę
i prolinę). Rozdział przeprowadzono w buforze fosforanowym o pH 2,3, a detekcję
spektrofotometryczną wykonano przy długości fali 185 nm [45].
Węglowodany
(
monosacharydy, oligosacharydy i polisacharydy) jako składniki
żywności odgrywają ważną rolę fizjologiczną, przede wszystkim energetyczną, w pra-
widłowym funkcjonowaniu organizmów żywych. Elektroforezę kapilarną wykorzysta-
no między innymi do oznaczania zawartości oligocukrów w ekstrakcie z zielonego
groszku (sacharoza, rafinoza, stachioza, werbaskoza i ajugoza) [3], napojach (glukoza
i fruktoza) [14], sokach owocowych (sacharoza, glukoza i fruktoza) [52].
Techniki elektroforezy kapilarnej są także bardzo często wykorzystywane
do oznaczania zawartości witamin rozpuszczalnych w wodzie z grupy B oraz witaminy
C, jak również nierozpuszczalnych w wodzie (A, D, E, K) w różnych produktach spo-
żywczych, np. w sokach owocowych [46], drożdżach [54], owocach i warzywach [50,
20], płatkach zbożowych oraz w mięsie [53]. Metodami elektroforezy kapilarnej
z dobrym rezultatem określa się zawartość witamin rozpuszczalnych w tłuszczach (α-,
γ-, δ- tokoferol, retinol i witamina D
3
) oraz witamin rozpuszczalnych w wodzie (wita-
miny B
1
, B
2
, B
3
, B
6
, C, B
12
, P, B
4
i kwas nikotynowy) w tabletkach multiwitamino-
wych [37, 8, 18, 26, 4]. W przypadku witamin rozpuszczalnych w wodzie najlepsze
rezultaty uzyskano, używając kwarcowej kapilary o średnicy 50 μm i długości 48,5 cm
oraz buforu boranowego o pH 8,5, a detekcję spektrofotometryczną wykonując przy
długości fali 225 nm [18].
Kolejną możliwością jest zastosowanie CE do rozdziału i ilościowego oznaczania
flawonoidów.
Związki te
są najliczniejszą podgrupą polifenoli występujących w żyw-
ności i charakteryzują się wysokim potencjałem przeciwutleniającym. W dostępnej
literaturze podano wiele przykładów z zakresu identyfikacji flawonoidów, m.in. w
rzepaku, gorczycy, brokułach [7], trzcinie cukrowej [16], owocach
Crataegus pinnati-
fida
[38].
Cao i wsp. [9] wykorzystali elektroforezę kapilarną z elektrochemiczną detekcją
(CE-ED) do oznaczenia takich flawonoidów, jak: epikatecholina, katecholina, rutyna,
apigenina, luteolina i kwercetyna, m.in. w ekstrakcie z miłorzębu dwuklapowego
(
Ginkgo biloba
L
.)
. Rozdział przeprowadzono w kwarcowej kapilarze o średnicy 25
μm, buforem rozdzielającym był bufor boranowy o pH 9,0. Natomiast Delgado i wsp.
[16] oznaczyli zawartość szeregu flawonoidów w miodzie metodą micelarnej chroma-
tografii elektrokinetycznej (takich jak: eryodoctyol, naringina, hesperytyna, pinobanki-
na, pinocembryna, mircetyna, kwercetyna, kamferol,
luteolina, apigenina, chryzyna,
galangina, genkwanina, tectochryzyna). Do rozdziału wykorzystano kapilary o średni-
cy 50 μm, bufor boranowy o pH 8,5, a detekcję spektrofotometryczną wykonywano
przy długości fali 340 nm. Stosując metodę kapilarnej elektroforezy strefowej istnieje
również możliwość analizy flawonoidów (pinocembryny, chryzyny, galanginy) i kwa-
[ Pobierz całość w formacie PDF ]