wyklad 5 inne enzymy, Biologia UMCS, Iº, V semestr, Inżynieria genetyczna
[ Pobierz całość w formacie PDF ]
//-->Aby manipulować genami niezbędne są odpowiednienarzędzia molekularne, które pozwalają uzyskać tzw.zrekombinowane DNA(umożliwiają rekombinacjęmateriału genetycznegoin vitroczyli w próbówce)Najważniejsze z nich to:•enzymy restrykcyjne•wektory DNA•inne enzymy np. ligazy, fosfatazy, polimerazy, kinazy,nukleazy•LigazyKatalizują tworzenie wiązań fosfodiestrowych między sąsiednimi grupami3’ OH i 5’ PO4w kwasach nukleinowych – DNA lub RNA.W reakcji tworzą się wysokoenergetyczne pośredniki z udziałem NAD+lubATP w zależności od typu ligazy.Funkcjain vivo:udział w replikacji opóźnionego pasma DNA,rekombinacja genetyczna, naprawa DNAZastosowanie ligazy w inżynieriigenetycznej:Rekombinacja DNAin vitro– łączeniecząsteczek kwasów nukleinowychlepkich lub tępych końców oraz szereginnych bardzo specyficznychzastosowań.Własności ligaz używanych w rekombinacji in vitroLigazySubstratykofaktorytemperaturalepkie tępe końce DNA-RNA RNA-RNA_______________________________________________________________________________________E.colitaktak*nienieNAD+Mg2+(1-3 mM) 10-15 CT4 fagataktak*tak*tak*ATP Mg2+(10 mM)4C15-25 CBakteriitermofilnychtaknienienieNAD+Mg2+(10 mM)24-37 CLigacja tępych końców jest znacznie mniej efektywnaFosfataza alkalicznaUsuwa 5’-fosforan z ssDNA, dsDNA i RNA, rNTP i dNTP. Metaloenzym (Zn II)Bakteryjna fosfataza alkaliczna (BAP) najbardziej efektywna, ale jest oporna naogrzewanie i detergenty. Z tego powodu trudno zakończyć reakcjędefosforylacji. Peryplazmatyczny enzym, działa w buforze Tris pH 8.0-9.0 wobecności niskich stężeń Zn+2(poniżej 1 mM).Alkaliczna fosfataza cielęca (CIAP –calfintestinal alkaline phosphatase)–mniejsza aktywność niż BAP, ale łatwiejsza do usunięcia (ogrzewanie 65 C – 30min lub 75 C – 10 min) w obecności 10 mM EDTA.Alkaliczna fosfataza z arktycznych krewetek (SAP –shrimp alkalinephosphatase)– aktywność podobna do CIAP, ale inaktywacja 65 C –15 min(zalecane 70 C – 20 min).Zastosowanie fosfatazy alkalicznej w inżynierii genetycznej:•defosforylacjatj. usuwanie 5’ fosforanów z wektorów trawionychenzymami restrykcyjnymi•jeżeliDNA wektora zostało strawionejednym enzymem restrykcyjnymdefosforylacja zapobiega jego zamykaniu się (autoligacji) wektora bezwstawki•traktowanieDNA fosfatazą zmniejsza niestety wydajność klonowania
[ Pobierz całość w formacie PDF ]