zadania mikrobiologia, Liceum, Biologia, Korepetycje, Doświadczenia biologiczne, Mikrobiologia
[ Pobierz całość w formacie PDF ]
Szkoła Festiwalu Nauki | Trojdena 4, 02-109 Warszawa
tel. (22) 659-55-33/610 | fax (22) 668-52-88
www.sfn.edu.pl | sfn@iimcb.gov.pl
Ćwiczenie 1: Mutageneza
Dzikie szczepy drożdży rosną na pożywce minimalnej (zawierającej tylko składniki niezbędne do
życia: źródło energii i węgla, sole mineralne, odpowiednie pH, wodę. Z tych substancji
mikroorganizm syntetyzuje sobie wszystkie potrzebne do życia związki). Mutanty pokarmowe
drożdży nie mają tej zdolności i w zależności od rodzaju mutacji trzeba dodawać do podłoża
hodowlanego brakujące składniki, np.: aminokwasy. Mutanty można otrzymywać naświetlając dziki
szczep drożdży światłem UV.
Masz do dyspozycji szalki, podłoża do hodowli drożdży pełne i minimalne, wszelkie dodatki
(aminokwasy, witaminy, antybiotyki). Zaproponuj doświadczenie:
1. Jak wyselekcjonować z mieszaniny drożdży dzikich po wystawieniu ich na działanie UV
mutanty pozbawione zdolności syntezy alaniny?
Przykład rozwiązania: Należy wysiać mieszaninę drożdży po mutagenezie na pożywkę pełną
(wyrosną wszystkie kolonie zdolne do życia, również mutanty pokarmowe). Następnie
posłużyć się metodą replik – odcisnąć na sterylnym kawałku flaneli kolonie rosnące na tak
przygotowane szalce wzorcowej i odciskać jej odbicia na przygotowanych szalkach z
podłożami selekcyjnymi. Poszukując mutanta ala- należy zrobić repliki na podłożu
minimalnym i na podłożu minimalnym z dodatkiem alaniny. Kolonie które nie rosną na
podłożu minimalnym, a rosną z dodatkiem alaniny to poszukiwane mutanty.
repliki
pełna
minimalna Minimalna + ala
2. Jak wyselekcjonować z mieszaniny drożdży dzikich po wystawieniu ich na działanie UV
mutanty pozbawione zdolności syntezy proliny?
3. Jak wyselekcjonować z tej samej mieszaniny podwójne mutanty – pozbawione zdolności
syntezy alaniny i proliny?
4. Co można zrobić, aby mutant ala- odzyskał zdolność do syntezy alaniny?
1
Szkoła Festiwalu Nauki | Trojdena 4, 02-109 Warszawa
tel. (22) 659-55-33/610 | fax (22) 668-52-88
www.sfn.edu.pl | sfn@iimcb.gov.pl
Ćwiczenie 2: Podłoża i hodowle bakteryjne
W probówce znajduje się mieszanina kilku szczepów bakterii
E. coli,
o podanych właściwościach.
Chcesz rozróżnić te bakterie. Jakie podłoża zastosować? Masz do dyspozycji: podłoże minimalne,
podłoże pełne, dowolne dodatki.
•
Szczep 1:
GyrA96 leuB
- oporny na kwas nalidiksowy (antybiotyk) i bakterie nie
potrafią syntetyzować leucyny
•
Szczep 3:
LacY metB
- bakterie nie potrafią wykorzystywać laktozy jako źródła węgla
i nie potrafią syntetyzować metioniny
•
Szczep 4:
ProAB rpsL
- bakterie nie potrafią syntetyzować proliny i są oporne na
streptomycynę (antybiotyk)
•
Dzikie
– bakterie mogą rosnąć na podłożu minimalnym, ale nie niosą żadnej oporności
na antybiotyki.
Podłoże minimalne:
podłoża minimalne mają różny skład w zależności od szczepu bakterii,
ale zawsze zawierają tylko składniki niezbędne do życia danego organizmu. Przykładowo,
podłoże minimalne dla
E. coli
zawiera: glukozę (jedyne źródło węgla), Na
2
HPO
4,
KH
2
PO
4,
NH
4
Cl,
NaCl, MgSO
4
i CaCl
2
– z tych substancji bakteria syntetyzuje sobie wszystkie potrzebne jej do
życia związki.
Podłoże pełne
zawiera wszystkie związki, których bakteria może potrzebować, także te bardzo
złożone. Co ważne – dokładny skład podłoża pełnego jest nieznany. Składa się ono bowiem
w większości z ekstraktów z hodowli drożdżowych i bakteryjnych – ich skład jest nieokreślony
ilościowo ani jakościowo, jednak wiadomo, że zawierają komplet związków potrzebnych
bakteriom do życia. Podłoża pełne są uniwersalne (takie same dla różnych szczepów bakterii).
Podpowiedź: należy zastosować metodę replik, podobnie jak w ćwiczeniu 1.
2
Szkoła Festiwalu Nauki | Trojdena 4, 02-109 Warszawa
tel. (22) 659-55-33/610 | fax (22) 668-52-88
www.sfn.edu.pl | sfn@iimcb.gov.pl
Ćwiczenie 3: Sklonuj sobie gen
Przykład jak można sklonować sobie gen”
Chcesz tak zmodyfikować szczep E.coli, który nie potrafi syntetyzować argininy(E.coli arg-), aby
zyskał tę zdolność. Masz do dyspozycji: wyjściowy szczep E.coli arg-, wrażliwy na ampicylinę i
tetracyklinę; szczep dziki E.coli; plazmid A (przedstawiony na rysunku), wszelkie dostępne
podłoża, i dodatki do nich, enzymy restrykcyjne i dobrze wyposażone laboratorium.
Przykładowy sposób postępowania:
a. Należy wyizolować i oczyścić DNA genomowe z dzikiego szczepu E.coli
b. Tak przygotowane DNA pociąć enzymem restrykcyjnym
c. Tym samym enzymem restrykcyjnym przeciąć plazmid A (enzym ten przecina plazmid tylko
w miejscu MUK)
d. Zmieszać pocięte plazmidy z pociętym DNA genomowym bakterii, przeprowadzić reakcję
ligacji. Powstanie zbiór kolistych cząsteczek plazmidowych, z których każda będzie niosła
inny fragment DNA genomowego bakterii E.coli oraz plazmidy wyjściowe nie niosące żadnej
wstawki. Uzyskaliśmy w ten sposób bibliotekę genomową E.coli.
e. Taką mieszaniną należy stransformować bakterie szczepu arg-
f. Wysiać na podłoża, które umożliwią selekcję bakterii a) niosących plazmid, b)niosących
plazmid ze wstawką, c) niosących plazmid którego wstawka niesie gen umożliwiający
produkcję argininy:
a) LB+amp: rosną bakterie posiadające plazmid
b) LB+amp+tet: rosną bakterie posiadające plazmid bez wstawki
Do dalszych testów bierzemy te kolonie, które wyrosły na podłożu z ampicyliną, ale znikły na
tetracyklinie.
c) Pożywka minimalna + amp: rosną poszukiwane bakterie – na pożywce minimalnej, na której
brak jest również argininy te bakterie umiały same wytworzyć argininę.
Na podstawie podanego przykładu przedstaw rozwiązanie następujących zadań:
Chcesz, aby szczep E.coli pro- (niezdolny do syntezy proliny) uzyskał zdolność do syntezy
proliny. Proszę dokonać tego za pomocą każdego z podanych plazmidów (plazmidu A i plazmidu B).
Proszę przedstawić kolejność wykonywanych czynności, skład podłoży oraz interpretację wyników
(„co znaczy, jeśli na tym podłożu ten szczep nie wyrośnie, a co znaczy jeśli wyrośnie”). Jakie będą
niezbędne kontrole w tym doświadczeniu?
Masz do dyspozycji:
•
Dziki szczep
E. coli
(wrażliwy na antybiotyki)
•
Laboratoryjny szczep
E. coli pro-
wrażliwy na antybiotyki oraz nie wytwarzający beta-
galaktozydazy)
•
Dwa plazmidy:
o
Plazmid A: zawiera gen oporności na ampicylinę oraz miejsce ułatwiające
klonowanie umieszczone wewnątrz genu oporności na tetracyklinę
3
Szkoła Festiwalu Nauki | Trojdena 4, 02-109 Warszawa
tel. (22) 659-55-33/610 | fax (22) 668-52-88
www.sfn.edu.pl | sfn@iimcb.gov.pl
o
Plazmid B: zawiera gen oporności na ampicylinę oraz miejsce ułatwiające
klonowanie umieszczone wewnątrz genu beta-galaktozydazy
Powyższymi plazmidami można transformować oba szczepy bakterii. Schematyczne
mapki tych plazmidów narysowane są w pkt. 2.
•
Enzymy restrykcyjne
•
Pożywki, enzymy i inne podstawowe odczynniki (agaroza, bromek, ampicylina,
tetracyklina, prolina, X-Gal itp.)
Tet
Gal
Amp
- gen oporności na
ampicylinę, wielkość 0,8
MUK
MUK
PLAZMID A
PLAZMID B
Tet
- gen
oporności na
Gal
- gen kodujący
beta-galaktozydazę,
Amp
Amp
MUK
– miejsce
ułatwiające klonowanie,
Uwagi:
•
Szczep dziki E.coli może rosnąć na podłożu minimalnym, umie sam syntetyzować
wszystkie niezbędne związki organiczne.
•
Podłoże minimalne: zawiera tylko składniki niezbędne do życia danego organizmu.
Przykładowo, podłoże minimalne dla E. coli zawiera: glukozę (jedyne źródło węgla),
Na2HPO4, KH2PO4, NH4Cl, NaCl, MgSO4 i CaCl2 – z tych substancji bakteria
syntetyzuje sobie wszystkie potrzebne jej do życia związki.
•
Sekwencja MUK – tzw. Sekwencja ułatwiająca klonowanie, to sekwencja którą przecina
większość powszechnie używanych enzymów restrykcyjnych
•
Dla potrzeb doświadczenia zakładamy, że działający gen Gal powoduje zabarwienie
kolonii na niebiesko, o ile w pożywce obecny jest związek X-Gal (nie jest to do końca
prawda, ale tu przyjmujemy, że tak jest)
•
4
Szkoła Festiwalu Nauki | Trojdena 4, 02-109 Warszawa
tel. (22) 659-55-33/610 | fax (22) 668-52-88
www.sfn.edu.pl | sfn@iimcb.gov.pl
Ćwiczenie 4: Zabawa w matematyka, czyli mapa restrykcyjna
Na rysunku poniżej zaznaczono schematyczne mapy plazmidów wraz z miejscami cięcia
odpowiednich enzymów restrykcyjnych (zakładamy, że dany plazmid tną tylko te wymienione
enzymy). Proszę narysować układ prążków na żelu po trawieniu tymi enzymami wg tabeli.
Proszę wpisać w tabelkę wielkości powstających fragmentów DNA, a następnie narysować układ
prążków na żelu. Podane wartości pod nazwami enzymów oznaczają odległość miejsca cięcia od
przyjętego punktu „0” na naszym rysunku znajdującego się na godzinie dwunastej (środek
sekwencji MUK). Wartości podane są w parach zasad.
PvuIII
7800
Tet
PvuIII,
800
Gal
BamHI
500
PvuIII,
7000
MUK
MUK
PLAZMID A 8500pz
PLAZMIDB4000pz
EcoRI
1200
AvaII,
2800
Amp
BamHI,
3000
Amp
Enzym
PAZMID A
AvaII
Jeden prążek wielkości 8500 pz
PvuIII
Trzy prążki: 800, 6200, 1500 pz
AvaII/PvuIII
Enzym
PLAZMID B
EcoRI
BamHI
EcoRI/BamHI
5
[ Pobierz całość w formacie PDF ]